Sí, es totalmente posible excitar más de un fluoróforo al mismo tiempo utilizando una sola fuente de luz. Es una técnica muy habitual en biología y química para observar simultáneamente distintas partes de una célula o muestra. Para conseguirlo, es necesario elegir el tipo de luz adecuado y utilizar el hardware apropiado para controlarla.
¿Qué es un fluoróforo?
Imagine un fluoróforo como un reflector microscópico que cambia el color de la luz. Cuando se ilumina con un color específico (la luz de excitación), el fluoróforo absorbe esa energía y brilla, emitiendo luz de un color diferente (la luz de emisión). Por ejemplo, un fluoróforo puede absorber luz azul y emitir luz verde.
Cómo una sola fuente de luz puede excitar múltiples objetivos
Hay dos formas principales en las que una única fuente de luz puede excitar simultáneamente varios fluoróforos diferentes:
- La potencia de la luz de amplio espectro: Algunas fuentes de luz, como los LED especiales de luz blanca o las lámparas halógenas, producen un amplio espectro de luz de «banda ancha». Esto significa que emiten luz azul, verde, roja y amarilla al mismo tiempo. Como todos los colores están presentes en un único haz, se puede excitar un fluoróforo que absorba luz azul y otro que absorba luz roja exactamente al mismo tiempo.
- Rangos de excitación compartidos: A veces, los espectros de excitación de distintos fluoróforos se solapan. Puede haber dos fluoróforos diferentes que se exciten con exactamente el mismo tono de luz azul, pero uno emita luz verde y el otro luz roja. Un único láser azul o haz de luz estrecho puede excitar ambos simultáneamente.
El hardware oculto: componentes ópticos
Si se irradia una muestra con luz blanca para excitar varios fluoróforos, ¿cómo se pueden observar claramente los resultados sin que todo quede oculto por un resplandor blanco cegador? Aquí es donde los componentes ópticos se convierten en la parte más importante del sistema.
Para interpretar la luz, se utilizan filtros ópticos especializados que dirigen su trayectoria:
- Filtros de excitación: Se colocan delante de la fuente de luz. Si se utiliza una fuente de amplio espectro, este filtro actúa como un portero: solo deja pasar hacia la muestra los colores de luz exactos necesarios para excitar los fluoróforos específicos y bloquea el resto.
- Espejos dicroicos: Son elementos de vidrio altamente especializados que se colocan en ángulo. Están diseñados para reflejar la luz de excitación hacia la muestra y permitir que la luz de emisión fluorescente de los fluoróforos pase directamente hasta los ojos o la cámara.
- Filtros de emisión: Se colocan justo delante de la cámara o del ocular. Bloquean la luz parásita procedente de la fuente de iluminación y solo dejan pasar los colores luminosos específicos, es decir, la luz de emisión, de los fluoróforos. Esto permite obtener un fondo oscuro y nítido con objetivos brillantes y luminosos.
Un problema habitual: «diafonía» o «filtración»
Al excitar varios fluoróforos a la vez, hay que evitar la «diafonía». Esta se produce cuando la luz emitida por el fluoróforo A atraviesa accidentalmente el filtro óptico destinado al fluoróforo B. Esto puede hacer parecer que el fluoróforo B está presente aunque no lo esté. Para evitarlo, se deben elegir fluoróforos con colores de emisión muy diferentes y utilizar filtros ópticos de emisión de alta precisión que mantengan las señales completamente separadas.
Resumen
Se puede utilizar una sola fuente de luz para excitar varios fluoróforos, normalmente empleando luz de amplio espectro o seleccionando fluoróforos que compartan un color de excitación. Sin embargo, el elemento decisivo de este proceso es la disposición de filtros ópticos y espejos que separan meticulosamente la luz para que los distintos colores fluorescentes puedan verse con claridad y precisión.
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