Introducción
Para comprender el solapamiento de señales, primero debemos saber cómo observan los científicos estructuras microscópicas como las células. Utilizan fluoróforos, diminutos «marcadores» moleculares luminosos que se adhieren a partes específicas de una célula. Cuando se iluminan con luz láser de un color específico (lo que se denomina excitación), absorben la energía y emiten luz de otro color (lo que se denomina emisión). Por ejemplo, se puede utilizar un fluoróforo verde para marcar el núcleo de una célula y uno rojo para marcar la membrana externa.
El concepto fundamental: la forma de la luz (espectros)
Es fácil imaginar que un fluoróforo verde emite un haz de luz verde perfectamente puro. Sin embargo, en realidad su espectro es mucho más complejo. Un fluoróforo verde emite luz principalmente verde, pero también presenta una pequeña emisión amarilla, una cantidad mínima de naranja y quizá una tenue traza de rojo.
Al representar en una gráfica los colores que emite un fluoróforo, se obtiene una colina ancha o una curva con forma de campana. Esta curva se denomina espectro de emisión.
¿Qué es la interferencia espectral (diafonía)?
La diafonía espectral (a menudo denominada interferencia cruzada) se produce cuando se utilizan dos o más fluoróforos al mismo tiempo y sus curvas de emisión se solapan.
Los equipos como microscopios o citómetros de flujo utilizan ventanas especiales de vidrio coloreado llamadas filtros para captar la luz emitida. Un «filtro verde» está diseñado para dejar pasar únicamente la luz verde hasta la cámara, mientras que un «filtro rojo» capta únicamente la luz roja.
Pero ¿qué ocurre si el extremo de la curva de su fluoróforo verde se prolonga hasta la zona roja? Esa luz adicional «se filtrará» a través del filtro rojo. La cámara detectará la luz y supondrá que procede del fluoróforo rojo, cuando en realidad es solo una fuga residual del verde.
Una analogía práctica: el problema del vidrio coloreado
Imagine que tiene una linterna amarilla muy brillante y otra linterna naranja mucho más tenue. Quiere observar el brillo de la linterna naranja, así que la mira a través de unas gafas de sol con cristales de color naranja.
Las gafas de sol están diseñadas para dejar pasar únicamente la luz naranja. Sin embargo, como la linterna amarilla es extremadamente brillante, una pequeña fracción de su luz atraviesa las lentes naranjas. Incluso si la linterna naranja está apagada, es posible que siga viendo luz a través de las gafas y crea erróneamente que está encendida. Así es exactamente como la diafonía genera confusión en las cámaras científicas.
¿Por qué es problemática la interferencia espectral?
El solapamiento espectral genera falsos positivos. Si un científico analiza la sangre de un paciente para determinar si está presente una célula inmunitaria rara específica, marcada en rojo, el solapamiento procedente de una célula muy común, marcada en verde, podría activar el detector rojo.
Esto afecta negativamente a la precisión de los datos. El científico podría concluir que la célula poco común está presente cuando en realidad no lo está, simplemente porque los colores se mezclaron dentro del equipo.
Cómo lo previenen y corrigen los científicos
Como los fluoróforos siempre presentan curvas de emisión amplias y complejas, los científicos utilizan varias estrategias para controlar la diafonía:
- Selección adecuada: La solución más sencilla es elegir colores muy separados en el espectro. Si se utilizan un fluoróforo azul y otro rojo oscuro, sus curvas están tan separadas que no se superponen en absoluto.
- Filtros más selectivos: La actualización del microscopio con filtros más estrictos y estrechos puede impedir físicamente que la luz solapada llegue a la cámara.
- Compensación: Este es un método matemático. Los ordenadores pueden entrenarse para determinar exactamente cuánta luz verde se filtra al canal rojo, por ejemplo, exactamente 15%. A continuación, el ordenador resta automáticamente 15% de los datos del canal rojo, eliminando matemáticamente la diafonía para revelar el resultado real.
Resumen
La diafonía espectral se produce cuando la luz de un marcador fluorescente llega al detector destinado a otro. Como las moléculas fluorescentes generan una amplia gama de colores en lugar de un único haz láser puro, su luz puede solaparse fácilmente. Al elegir los colores adecuados, utilizar buenos filtros y aplicar correcciones matemáticas, los científicos pueden reducir la interferencia y obtener imágenes precisas de alta calidad.
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