Un microscopio de epifluorescencia es un tipo de microscopio óptico que utiliza la fluorescencia en lugar de la dispersión, la reflexión y la absorción, o además de ellas, para estudiar las propiedades de sustancias orgánicas o inorgánicas. El término «epi» proviene de la palabra griega que significa «encima» y alude al hecho de que tanto la iluminación como la detección se realizan desde el mismo lado de la muestra, a través del objetivo.

Principios de funcionamiento

El principio fundamental de la epifluorescencia es el desplazamiento de Stokes. Cuando una muestra se marca con un fluoróforo, una sustancia química fluorescente, absorbe luz a una longitud de onda específica y más corta (excitación) y emite luz a una longitud de onda más larga y de menor energía (emisión).

1. Excitación: La luz de alta intensidad se filtra a una longitud de onda específica y un espejo dicroico la refleja a través del objetivo hacia la muestra.
2. Emisión: Los fluoróforos de la muestra emiten luz. Esta luz regresa a través del objetivo.
3. Separación: Como la luz emitida tiene una longitud de onda más larga, atraviesa el espejo dicroico, mientras que la luz de excitación reflejada queda bloqueada. De este modo, solo la señal fluorescente llega a los oculares o a la cámara.

Construcción física

La arquitectura de un microscopio de epifluorescencia está definida por el cubo de filtros de fluorescencia, que normalmente contiene tres elementos esenciales:

• Filtro de excitación: Selecciona de la fuente de luz la banda específica de longitudes de onda que excita la muestra.
• Espejo dicroico (divisor de haz): Es un espejo especializado que refleja las longitudes de onda más cortas (excitación) y transmite las longitudes de onda más largas (emisión). Se coloca formando un ángulo de 45° con respecto a la trayectoria óptica.
• Filtro de emisión (filtro de barrera): Bloquea cualquier luz de excitación residual y garantiza que solo la fluorescencia de la muestra llegue al detector.
• Fuente de luz: Tradicionalmente se utilizan lámparas de arco de mercurio o xenón, aunque los sistemas modernos emplean principalmente LED de alta potencia o láseres.

Parámetros ópticos clave

Para evaluar o especificar un sistema de epifluorescencia, son esenciales las siguientes métricas:

• Apertura numérica (NA): Es fundamental porque el objetivo actúa tanto como condensador (suministra la luz) como colector. La intensidad de fluorescencia aumenta con la cuarta potencia de la NA: Intensidad ∝ (NA)4.
• Rendimiento cuántico: La relación entre los fotones emitidos y los fotones absorbidos por el fluoróforo.
• Coeficiente de extinción: Una medida de la intensidad con la que un fluoróforo absorbe luz a una longitud de onda determinada.
• Relación señal-ruido (SNR): La capacidad de distinguir la señal fluorescente del fondo oscuro.

Clasificaciones y tipos

• Epifluorescencia vertical: El objetivo se encuentra por encima de la platina; es la configuración estándar para portaobjetos preparados.
• Epifluorescencia invertida: El objetivo se encuentra debajo de la platina, lo cual es esencial para observar células vivas en placas o frascos de cultivo.
• Fluorescencia confocal: Una variante especializada que utiliza un diafragma estenopeico para eliminar la luz desenfocada, lo que permite obtener secciones ópticas en 3D.
• Fluorescencia de reflexión interna total (TIRF): Utiliza una onda evanescente para excitar selectivamente fluoróforos solo dentro de ~100 nm de la superficie del vidrio.

Aplicaciones

• Biología celular: Identificación de proteínas u orgánulos específicos mediante la proteína verde fluorescente (GFP) o la inmunofluorescencia.
• Genética: Hibridación fluorescente in situ (FISH) para identificar la presencia o ausencia de secuencias específicas de DNA en los cromosomas.
• Diagnóstico clínico: Detección de patógenos (p. ej., las bacterias que causan la tuberculosis o la malaria) en muestras de pacientes.
• Ciencia de materiales: Inspección de semiconductores o minerales que presentan autofluorescencia.

Ejemplo práctico: detección de «Proteína X» en una célula cancerosa

En un laboratorio, un investigador quiere determinar si una proteína específica está presente en el núcleo de una célula.

1. Preparación: La muestra se trata con un anticuerpo primario que se une a «Protein X», seguido de un anticuerpo secundario marcado con FITC (un fluoróforo verde de uso común).
2. Configuración: El microscopio está equipado con un «juego de filtros FITC» (excitación: ~480nm; emisión: ~520nm).
3. Observación: La luz azul se envía a través del objetivo. Cuando el investigador mira por el ocular, el fondo se ve completamente negro, pero los núcleos de las células brillan con un verde neón intenso y nítido, lo que confirma la ubicación de la proteína.