Verificar los valores exactos de aislamiento (ancho de banda espectral) o densidad óptica (OD) es fundamental para garantizar la precisión de los espectrofotómetros y lectores de microplacas. La validación suele basarse en una combinación de patrones físicos trazables al NIST y soluciones químicas.
1. Verificación de la densidad óptica (precisión fotométrica)
La exactitud fotométrica garantiza que el valor de absorbancia mostrado por el instrumento coincida con la absorbancia real de la muestra.
- Filtros de densidad neutra (ND) : Para la verificación de amplio espectro, se utilizan filtros ND metálicos o de vidrio con trazabilidad al NIST. Estos proporcionan valores de OD estables (p. ej., 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0) en un amplio intervalo de longitudes de onda.
- Dicromato de potasio (K2Cr2O7): Es el patrón de referencia para verificar el intervalo UV (235 nm a 350 nm). Se preparan soluciones de distintas concentraciones en ácido sulfúrico 0.005M.
- Prueba de luz parásita: Los valores altos de OD pueden verse alterados por la «luz parásita», es decir, la radiación situada fuera del ancho de banda objetivo. Esto se verifica mediante filtros de corte como el yoduro de potasio (KI), que debería mostrar una opacidad casi total en determinadas longitudes de onda UV.
2. Verificación de la precisión de la longitud de onda (aislamiento)
La precisión de la longitud de onda garantiza que el instrumento esté realmente «aislado» en el valor objetivo en nanómetros (nm).
- Vidrio de óxido de holmio o didimio: Estos filtros presentan picos de absorción muy pronunciados y bien definidos en todo el espectro UV-Vis. Al escanearlos, se puede verificar si el instrumento detecta el pico en la longitud de onda documentada exacta.
- Líneas de emisión atómica: Para obtener el máximo nivel de precisión, se utilizan lámparas de descarga de gas (como las de mercurio o deuterio). Estas emiten luz en constantes físicas fundamentales (por ejemplo, la línea de mercurio en 253.65 nm), lo que proporciona un punto de referencia absoluto.
3. Verificación del ancho de banda espectral (SBW)
El ancho de banda espectral (la «anchura» del haz de luz que sale de la rendija) determina la resolución del instrumento.
- Tolueno en hexano: Una prueba habitual de resolución. Se mide la relación entre el máximo de absorbancia a 269 nm y el mínimo de absorbancia a 266 nm. Una relación más alta indica un ancho de banda espectral más estrecho y preciso.
- Prueba del ancho de rendija: Si el instrumento tiene una rendija variable, su anchura física puede verificarse midiendo la anchura a media altura (FWHM) de una línea de emisión estrecha de una lámpara de mercurio.
Comparación de métodos de verificación
| Parámetro | Patrón primario | Longitudes de onda típicas |
| Precisión fotométrica | Filtros de densidad neutra | 400 nm – 800 nm |
| Exactitud UV | Dicromato de potasio | 235 nm, 257 nm, 313 nm, 350 nm |
| Exactitud de la longitud de onda | Vidrio de óxido de holmio | Múltiples picos (p. ej., 241 nm, 361 nm, 536 nm) |
| Luz parásita | Yoduro de sodio (NaI) | < 220 nm |
Buenas prácticas de verificación
- Calentamiento: Deje siempre que las lámparas del instrumento se estabilicen durante 15–30 minutos antes de realizar las pruebas.
- Control de temperatura: Los valores fotométricos de patrones químicos como el dicromato de potasio dependen de la temperatura; asegúrese de que el laboratorio se mantenga a una temperatura estable de 20–25°C.
- Recertificación: Los filtros físicos deben enviarse de nuevo al fabricante o a un laboratorio de metrología cada 1–2 años para su recertificación, a fin de tener en cuenta la solarización del vidrio o la degradación de la superficie.
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