免疫蛍光染色はどのように行われますか?
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免疫蛍光染色
導入
免疫蛍光染色は、抗体の抗原への結合特異性を利用して蛍光顕微鏡で可視化することにより、細胞または組織切片内の特定のタンパク質または抗原を可視化する技術です。この方法により、研究者は細胞または組織切片内の標的分子の存在、量、および局在を調べることができます。
材料と試薬
- サンプル（細胞または組織切片）
- 標的抗原に特異的な一次抗体
- 蛍光標識二次抗体
- ブロッキング溶液（BSAまたは血清など）
- 緩衝液（例：PBS）
- 固定剤（例：ホルムアルデヒド）
- 透過処理溶液（例：Triton X-100）
- 封入剤
- DAPIまたはその他の核染色（オプション）
手順
- サンプルの準備:細胞または組織切片は、細胞構造を保存し、タンパク質を固定するために、ホルムアルデヒドなどの固定剤で固定されます。その後、通常はトリトン X-100 などの洗剤を使用して透過処理を行い、抗体が細胞内抗原にアクセスしやすくなります。
- ブロッキング:抗体の非特異的結合を防ぐため、サンプルは通常ウシ血清アルブミン (BSA) または血清で構成されるブロッキング溶液中でインキュベートされます。
- 一次抗体のインキュベーション:サンプルは、標的抗原に特異的な一次抗体とともにインキュベーションされます。一次抗体のインキュベーションは、最適な結合に適した温度 (通常は 4 ℃) で数時間から一晩実行されます。
- 洗浄:インキュベーション後、サンプルをバッファーで洗浄して、結合していない一次抗体を除去します。
- 二次抗体インキュベーション:一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体をサンプルに適用します。この抗体は、特定の波長で励起されると光を発する蛍光体と結合しています。
- さらなる洗浄:余分な二次抗体をバッファーで洗い流します。
- 核染色（オプション）：核を視覚化する必要がある場合は、DAPI などの DNA 結合染料を使用して核を染色できます。
- マウント:サンプルは蛍光を保存し、光退色を防ぐ媒体でマウントされます。サンプルの上にカバーガラスを置き、光の屈折を減らします。
- 顕微鏡検査:サンプルは蛍光顕微鏡で観察され、蛍光信号が検出されて画像化されます。蛍光体がそれぞれ異なる励起スペクトルと発光スペクトルを持っている場合、複数のターゲットを視覚化する必要がある場合は、複数回の染色を実行することができます。
結論
免疫蛍光染色は、細胞生物学や病理学において、細胞や組織切片内のタンパク質を特異的に検出する強力で広く使用されている技術です。特定の抗体、蛍光染料、適切なプロトコルを使用して、細胞の機能、構造、相互作用の研究に役立つ画像を生成します。