落射荧光显微镜是一种光学显微镜，它利用荧光代替或结合散射、反射和吸收来研究有机或无机物质的特性。“Epi”一词来源于希腊语，意为“上方”，指的是照明和检测都从标本的同一侧（通过物镜）进行。
工作原理
落射荧光的基本原理是斯托克斯位移。当标本用荧光团（一种荧光化学物质）标记时，它会在特定的较短波长（激发）处吸收光，并在较长、能量较低的波长（发射）处发射光。
- 激发：高强度光被过滤到特定波长，并通过二向色镜通过物镜反射到样品上。
- 发射：样品中的荧光团发光。这种光通过物镜返回。
- 分离：由于发射光的波长较长，它会穿过二向色镜（而反射的激发光被阻挡），从而只允许荧光信号到达目镜或相机。
物理结构
落射荧光显微镜的结构由荧光滤光片组决定，该滤光片组通常包含三个关键元件：
- 激发滤光片：从光源中选择特定波长带以激发样品。
- 二向色镜（分束器）：一种特殊反射较短波长（激发）并透射较长波长（发射）的镜子。它以45°角放置在光路中。
- 发射滤光片（阻挡滤光片）：阻挡任何残留的激发光，并确保只有来自样品的荧光到达检测器。
- 光源：传统上是汞灯或氙弧灯，但现代系统主要使用高功率LED或激光器。
关键光学指标
要评估或指定落射荧光系统，以下指标至关重要：
- 数值孔径（NA）：至关重要，因为物镜既充当聚光器（传输光线）又充当收集器。荧光强度随NA的四次方增加：强度 ∝ (NA)4。
- 量子产率：荧光团发射的光子数与吸收的光子数之比。
- 消光系数：衡量荧光团在给定波长下吸收光强度的指标。
- 信噪比（SNR）：区分荧光信号与暗背景的能力。
分类和类型
- 正置落射荧光：物镜位于载物台上方；适用于制备好的载玻片。
- 倒置落射荧光：物镜位于载物台下方；对于观察培养皿或烧瓶中的活细胞至关重要。
- 共聚焦荧光：一种特殊版本，使用针孔消除离焦光，实现3D光学切片。
- 全内反射荧光（TIRF）：利用倏逝波选择性地激发仅在玻璃表面约100纳米范围内的荧光团。
应用
- 细胞生物学：使用绿色荧光蛋白（GFP）或免疫荧光识别特定蛋白质或细胞器。
- 遗传学：荧光原位杂交（FISH）以识别染色体上特定DNA序列的存在或缺失。
- 临床诊断：检测患者样本中的病原体（例如，导致结核病或疟疾的细菌）。
- 材料科学：检查表现出自发荧光的半导体或矿物。
实际案例：检测癌细胞中的“蛋白质X”
在实验室环境中，研究人员想了解特定蛋白质是否存在于细胞核中。
- 准备：样品用与“蛋白质X”结合的一抗处理，然后用FITC（一种常见的绿色荧光团）标记的二抗处理。
- 设置：显微镜配备“FITC滤光片组”（激发波长：~480nm；发射波长：~520nm）。
- 观察：蓝光通过物镜。当研究人员通过目镜观察时，背景漆黑一片，但细胞核发出明亮、锐利的霓虹绿光，证实了蛋白质的位置。
