落射荧光显微镜是一种光学显微镜，它使用荧光替代散射、反射和吸收，或将荧光与这些效应结合，以研究有机或无机物质的性质。“Epi”一词源于表示“上方”的希腊语，指照明和检测均从样品的同一侧通过物镜进行。
工作原理
落射荧光的基本原理是斯托克斯位移。当使用荧光团（一种荧光化学物质）标记样品时，样品会吸收特定的较短波长光（激发），并发射波长更长、能量更低的光（发射）。
- 激发：高强度光经过滤光后获得特定波长，再由二向色镜反射，经物镜照射到样品上。
- 发射： 样品中的荧光团发出光线。该光线通过物镜返回。
- 分离：由于发射光的波长较长，因此它会透过二向色镜，而反射的激发光则被截止，使得只有荧光信号到达目镜或相机。
物理结构
落射荧光显微镜的结构由荧光滤光片立方体决定，其中通常包含三个关键元件：
- 激发滤光片： 从光源中选择用于激发样品的特定波段。
- 二向色镜（分光镜）：一种反射较短波长（激发光）并透射较长波长（发射光）的专用反射镜。它与光路呈45°角放置。
- 发射滤光片（屏障滤光片）：阻挡任何残余激发光，确保只有样品发出的荧光到达探测器。
- 光源： 传统上使用汞弧灯或氙弧灯，而现代系统主要使用高功率LED或激光器。
关键光学指标
评估或定义落射荧光系统的规格时，以下指标至关重要：
- 数值孔径（NA）：这一参数非常重要，因为物镜既用作聚光器（传递光线），也用作集光器。荧光强度随 NA 的四次方增大：强度 ∝ (NA)4。
- 量子产率： 荧光团发射的光子数与其吸收的光子数之比。
- 消光系数：衡量荧光团在给定波长下吸收光线强度的指标。
- 信噪比（SNR）：从暗背景中区分荧光信号的能力。
分类和类型
- 正置落射荧光： 物镜位于载物台上方，是观察制备载玻片的标准配置。
- 倒置落射荧光: 物镜位于载物台下方，是观察培养皿或培养瓶中活细胞的必要配置。
- 共聚焦荧光： 一种使用针孔消除离焦光的专用方法，可实现 3D 光学切片。
- 全内反射荧光（TIRF）：利用倏逝波，仅选择性激发距玻璃表面 ~100 nm 范围内的荧光团。
应用
- 细胞生物学： 使用绿色荧光蛋白（GFP）或免疫荧光法识别特定蛋白质或细胞器。
- 遗传学： 采用荧光原位杂交 (FISH) 识别染色体上是否存在特定DNA序列。
- 临床诊断: 检测患者样本中的病原体（例如，引起结核病或疟疾的细菌）。
- 材料科学： 检测具有自发荧光的半导体或矿物。
实际示例：检测癌细胞中的“蛋白质X”
在实验室环境中，研究人员希望确认细胞核中是否存在某种特定蛋白质。
- 制备：先使用与“Protein X”结合的一抗处理样品，然后使用标记有FITC（一种常见的绿色荧光团）的二抗进行处理。
- 配置：显微镜配备“FITC 滤光片组”（激发：~480nm；发射：~520nm）。
- 观察结果： 蓝光通过物镜照射。研究人员从目镜观察时，背景呈漆黑色，而细胞核发出明亮、清晰的荧光绿色光，从而确认蛋白质的位置。
