Wie funktioniert ein Fluoreszenzmikroskop?
Bei einem Fluoreszenzmikroskop unterscheidet sich der Lichtweg deutlich von dem eines normalen Lichtmikroskops, da das Licht speziell angeregt und gefiltert werden muss. Hier ist eine Aufschlüsselung des Lichtwegs:
Lichtquelle
Die Reise beginnt mit einer leistungsstarken Lichtquelle, häufig einer Xenon-Bogenlampe oder einer Hochleistungs-LED. Diese Lichtquelle strahlt ein breites Spektrum weißen Lichts aus, das viele verschiedene Farben (Wellenlängen) enthält.
Epi-Beleuchtung
(Traditionell links, Auflichtbeleuchtung rechts)
Was bedeutet Auflichtbeleuchtung?
Eine Objektivlinse dient dazu, das Anregungslicht auf eine Probe zu fokussieren und Emissionslicht zu sammeln. Bei der Fluoreszenzmikroskopie bedeutet dies, dass der Benutzer dem Anregungslicht nicht ausgesetzt ist.
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Anregungsfilter
Anschließend passiert das Licht einen Anregungsfilter. Dieser Filter wirkt wie ein farbiger Torwächter, der nur einen bestimmten Wellenlängenbereich passieren lässt. Dieser ausgewählte Bereich sollte mit dem Absorptionspeak des im Experiment verwendeten Fluorophors übereinstimmen.
Dichroitischer Spiegel
Das gefilterte Licht trifft auf einen dichroitischen Spiegel, der wie ein cleverer Licht-Verkehrspolizist wirkt. Er reflektiert die spezifischen Anregungswellenlängen, die von unten auf die Probe kommen. Dies ist das Licht, das die Fluorophore anregt.
Spannende Fluorophore
Das reflektierte Anregungslicht erreicht die Probe. Entspricht der Absorptionsbereich des Fluorophors der gewählten Anregungswellenlänge, wird das Licht vom Fluorophor absorbiert und dieser dadurch angeregt.
Fluoreszenzemission
In einem angeregten Zustand bleibt der Fluorophor nicht lange an Ort und Stelle. Er gibt die absorbierte Energie fast sofort frei, aber auf besondere Weise – indem er Licht mit einer längeren Wellenlänge (geringerer Energie) im Vergleich zum absorbierten Licht aussendet. Dieses emittierte Licht bringt den Fluorophor zum „Leuchten“.
Emissionsfilter
Das emittierte Fluoreszenzlicht gelangt zurück durch die Objektivlinse. Hier kommt ein weiterer Filter, der Emissionsfilter, ins Spiel. Dieser Filter blockiert das verbleibende Anregungslicht (das von der Probe reflektiert wird) und lässt nur die spezifischen Fluoreszenzemissionswellenlängen des Fluorophors passieren.
Den Detektor erreichen
Schließlich gelangt das gefilterte Fluoreszenzlicht zur visuellen Beobachtung in die Okulare oder zur Bildaufnahme in einen Detektor (z. B. eine Kamera). So können die Forscher nur das leuchtende Signal der Fluorophore sehen, wodurch die für sie interessanten Strukturen oder Moleküle in der Probe hervorgehoben werden.