Wie erkennt Fura-2 Kalzium?

Grundlegendes zu Fura-2 zur Kalziumerkennung

Fura-2 ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in der biologischen und biochemischen Forschung häufig zur Erkennung und Quantifizierung intrazellulärer Calciumwerte (Ca ²⁺ ) verwendet wird. Sein Wirkungsmechanismus basiert auf seiner Fähigkeit, an Calciumionen zu binden, was zu einer Änderung seiner Fluoreszenzeigenschaften führt. Diese Änderung kann quantitativ gemessen werden, sodass Forscher die Calciumdynamik in Zellen überwachen können.

So funktioniert Fura-2

Fura-2 ist ein ratiometrischer Farbstoff, d. h. er kann Licht bei zwei verschiedenen Wellenlängen absorbieren, und das Verhältnis der emittierten Fluoreszenz bei diesen Wellenlängen ändert sich als Reaktion auf die Calciumbindung. Insbesondere hat Fura-2 zwei Anregungsspitzen, eine bei etwa 340 nm und eine weitere bei 380 nm, während seine Emissionsspitze bei etwa 510 nm liegt.

Wenn Fura-2 im Zytoplasma frei ist, absorbiert es bevorzugt Licht bei 380 nm. Bei der Bindung an Calciumionen ändert sich seine chemische Struktur, was dazu führt, dass es bevorzugt Licht bei 340 nm absorbiert. Durch Messung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses des nach Anregung bei diesen beiden Wellenlängen emittierten Lichts können Forscher die Konzentration freier Calciumionen in der Zelle bestimmen.

Verfahren zum Nachweis von Calcium mit Fura-2

• Die Beladung der Zellen mit Fura-2 erfolgt durch Inkubation mit der zelldurchlässigen Acetoxymethyl(AM)-Esterform des Farbstoffs.
• Im Inneren der Zelle spalten Esterasen die AM-Gruppen und fangen den Farbstoff im Zytoplasma ein.
• Anschließend werden die Zellen abwechselnd mit Wellenlängen von 340 nm und 380 nm beleuchtet.
• Die emittierte Fluoreszenz bei 510 nm wird für beide Anregungswellenlängen gemessen.
• Es wird das Verhältnis dieser Fluoreszenzintensitäten berechnet, welches direkt proportional zur intrazellulären Calciumkonzentration ist.

Diese ratiometrische Messung kompensiert potenzielle Probleme wie Farbstoffkonzentration, Zelldicke und Photobleichung und macht Fura-2 zu einem zuverlässigen Werkzeug zum Studium der Kalziumsignalisierung in Zellen.