Welche Farbstoffe werden bei der Durchflusszytometrie verwendet?

In der Durchflusszytometrie verwendete Farbstoffe

Die Durchflusszytometrie ist eine Technik zum Erkennen und Messen physikalischer und chemischer Eigenschaften einer Zell- oder Partikelpopulation. Bei diesem Verfahren werden verschiedene fluoreszierende Farbstoffe verwendet, um Zellen und ihre Bestandteile zu färben. Diese Farbstoffe emittieren Licht bei verschiedenen Wellenlängen, wenn sie durch Laser angeregt werden. Die Wahl des Farbstoffs hängt von den spezifischen Anwendungen, den im Durchflusszytometer verfügbaren Lasern und Filtern sowie der Notwendigkeit ab, Überlappungen mit anderen Farbstoffen zu vermeiden, wenn mehrere Markierungen verwendet werden.

Häufig verwendete Farbstoffe

• Fluoresceinisothiocyanat (FITC): Ein hellgrüner Fluoreszenzfarbstoff, der durch einen 488-nm-Laser angeregt wird.
• Phycoerythrin (PE): Ein Protein aus Cyanobakterien und eukaryotischen Algen, das bei Anregung durch 488 nm- oder 532 nm-Laser im gelben bis orangenen Bereich fluoresziert.
• Allophycocyanin (APC): Ein Protein, das im roten Bereich emittiert, angeregt durch einen 633 nm- oder 647 nm-Laser.
• Peridinin-Chlorophyll-Proteine ​​(PerCP): Ein Proteinkomplex von Dinoflagellaten mit einem Absorptionsbereich, der zu seiner Verwendung in der Durchflusszytometrie beiträgt, üblicherweise angeregt durch den 488-nm-Laser.
• PE-Cy5: Ein Tandemfarbstoff, bei dem PE chemisch an Cy5 gebunden ist, was bei Anregung durch 488-nm- oder 532-nm-Laser eine Emission im fernen Rotbereich ermöglicht.
• PE-Cy7: Ähnlich wie PE-Cy5, emittiert jedoch bei einer längeren Wellenlänge.

Überlegungen zur Farbstoffauswahl

Die Auswahl der Farbstoffe richtet sich nach der jeweiligen Anwendung. Zu den Faktoren gehören:
- Fluorochrome Helligkeit: Die inhärente Fluoreszenzintensität des Farbstoffs.
- Anregungs- und Emissionsspektren: Die Kompatibilität des Farbstoffs mit den im Durchflusszytometer verfügbaren Laserlinien und Filtern.
- Größe und Komplexität des Panels: Bei Mehrfarben-Assays sind Panelgröße und -komplexität wichtig, um spektrale Überlappungen zu minimieren.
- Fluorochrom-zu-Protein-Verhältnis: Bei konjugierten Farbstoffen beeinflusst dieses Verhältnis die Helligkeit und Aggregation.
- Zelltyp und Antigene: Bestimmte Farbstoffe können je nach Zelltyp und den anzuvisierenden Antigenen unterschiedlich binden.

Mehrfarbige Durchflusszytometrie-Panels

Bei der Mehrfarben-Durchflusszytometrie werden mehrere Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig verwendet, um verschiedene Ziele zu markieren. Dies erfordert sorgfältige Planung, um Überlappungen der Emissionsspektren zu vermeiden, die zu Fehlinterpretationen der Daten führen könnten. Um spektrale Überlappungen zu korrigieren, wird häufig eine Kompensation eingesetzt. Dabei wird das Fluoreszenzsignal eines Farbstoffs, das im Kanal eines anderen erkannt wird, elektronisch korrigiert.

Abschluss

Fluoreszierende Farbstoffe spielen in der Durchflusszytometrie eine entscheidende Rolle, da sie die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter ermöglichen. Die Auswahl der Farbstoffe ist ein entscheidender Schritt bei der Gestaltung eines Durchflusszytometrieexperiments und kann die Qualität und Interpretierbarkeit der Ergebnisse erheblich beeinflussen.