落射蛍光顕微鏡は、散乱、反射、吸収の代わりに、またはそれらに加えて蛍光を利用し、有機物質や無機物質の特性を調べる光学顕微鏡の一種です。「Epi」という語はギリシャ語の「上」に由来し、照明と検出の両方が試料の同じ側から、対物レンズを通して行われることを示します。
動作原理
落射蛍光の基本原理はストークスシフトです。試料を蛍光色素（蛍光性化学物質）で標識すると、特定の短波長の光を吸収し（励起）、より長波長でエネルギーの低い光を放出します（蛍光発光）。
- 励起：高強度光を特定の波長にフィルタリングし、ダイクロイックミラーで反射させ、対物レンズを通して試料に照射します。
- 発光: 試料内の蛍光色素が光を放出します。この光は対物レンズを通って戻ります。
- 分離：発光は波長が長いためダイクロイックミラーを透過し、反射された励起光は遮断されます。これにより、蛍光信号のみが接眼レンズまたはカメラに到達します。
物理構造
落射蛍光顕微鏡の構成は、通常3つの重要な要素を含む蛍光フィルターキューブによって決まります:
- 励起フィルター: 光源から、試料を励起する特定の波長帯域を選択します。
- ダイクロイックミラー（ビームスプリッター）：短波長光（励起光）を反射し、長波長光（蛍光）を透過する特殊なミラーです。光路に対して45°の角度で配置されます。
- 蛍光フィルター（バリアフィルター）：残留する励起光を遮断し、試料からの蛍光のみが検出器に到達するようにします。
- 光源： 従来は水銀またはキセノンアークランプが使用されていましたが、現在のシステムでは主に高出力LEDまたはレーザーが使用されています。
主要な光学指標
落射蛍光システムの評価または仕様策定には、次の指標が不可欠です。
- 開口数（NA）：対物レンズはコンデンサー（光を照射）と集光器の両方として機能するため、開口数は重要です。蛍光強度はNAの4乗に比例して増加します：強度 ∝ (NA)4。
- 量子収率： 蛍光体が吸収した光子数に対する放出した光子数の比。
- モル吸光係数：特定の波長において蛍光色素が光を吸収する強さを示す指標。
- 信号対雑音比（SNR）：蛍光信号を暗い背景から識別する能力。
分類と種類
- 正立落射蛍光: 対物レンズがステージの上方に配置され、作製済みスライド標本の観察に標準的に使用されます。
- 倒立落射蛍光法: 対物レンズがステージの下に配置されており、培養皿や培養フラスコ内の生細胞の観察に不可欠です。
- 共焦点蛍光： ピンホールを使用して焦点外の光を除去し、3D光学セクショニングを可能にする特殊な方式です。
- 全反射蛍光（TIRF）： エバネッセント波を利用して、ガラス表面から ~100 nm 以内の蛍光色素のみを選択的に励起します。
用途
- 細胞生物学： 緑色蛍光タンパク質（GFP）または免疫蛍光法を用いて、特定のタンパク質や細胞小器官を同定します。
- 遺伝学： 染色体上の特定のDNA配列の有無を特定する蛍光in situハイブリダイゼーション (FISH)。
- 臨床診断: 患者検体中の病原体（例: 結核やマラリアの原因菌）を検出します。
- 材料科学: 自家蛍光を示す半導体や鉱物の検査。
実例：がん細胞内の「タンパク質X」の検出
実験室で、研究者が特定のタンパク質が細胞核内に存在するかどうかを確認しようとしています。
- 前処理: 試料を「Protein X」に結合する一次抗体で処理し、続いてFITC（一般的な緑色蛍光色素）で標識した二次抗体で処理します。
- 構成: 顕微鏡には「FITCフィルターセット」(励起: ~480nm、蛍光: ~520nm) が装備されています。
- 観察: 青色光を対物レンズに通します。研究者が接眼レンズをのぞくと、背景は漆黒ですが、細胞核は鮮明で鮮やかなネオングリーンに発光し、タンパク質の位置が確認できます。
