형광단의 배경 신호가 매우 높은 이유는 무엇입니까?

소개: 신호와 노이즈의 경쟁

형광단을 사용할 때의 목표는 어둡고 신호가 없는 배경에서 밝고 특이적인 표적을 관찰하는 것입니다. 배경이 너무 높으면 이미지나 측정값이 흐릿하고 색이 바랜 것처럼 보입니다. 이는 일반적으로 염료의 화학적 특성, 시료의 성질 또는 장비의 광학 구성이라는 세 가지 원인 중 하나로 발생합니다.

화학적 요인: 형광단 관련 문제

과도한 염료(과농도)

높은 배경 신호의 가장 흔한 원인은 단순히 염료를 너무 많이 사용하는 것입니다. 형광단 농도가 너무 높으면 염료 분자가 표적을 포화시킨 다음 주변 액체에 유리 상태로 떠다니거나 유리 슬라이드에 침착되기 시작합니다.

• 해결 방법: 형광단을 희석해 보십시오. 여러 가지 낮은 농도를 시험하는 “적정”을 수행하면 표적은 밝게 보이면서 배경은 어둡게 유지되는 최적의 농도를 찾을 수 있습니다.

점착성 염료(비특이적 결합)

형광단은 특정 표적에 결합하도록 설계된 항체나 기타 분자에 부착되는 경우가 많습니다. 그러나 때로는 다른 단백질, 용기 가장자리 또는 무작위 세포 잔해처럼 결합해서는 안 되는 대상에 결합하기도 합니다. 이를 "비특이적 결합"이라고 합니다.

• 해결 방법: 블로킹 단계를 개선하십시오. 형광단을 추가하기 전에 BSA나 정상 혈청과 같은 블로킹 완충액을 사용하면 시료의 "잘 달라붙는" 부분을 코팅하여 올바른 표적만 염료와 결합할 수 있도록 남겨 둡니다. 결합하지 않은 염료를 씻어 내기 위해 세척 단계의 횟수나 시간을 늘려야 할 수도 있습니다.

시료: 내부에서 발생하는 문제

자연적인 발광(자가형광)

높은 배경 신호가 형광단에서 발생한 것이 아닌 경우도 있습니다. 식물 조직, 특정 단백질, 적혈구 등 많은 생물학적 물질은 빛을 받으면 자연적으로 발광합니다. 이러한 자연 발광을 자가형광이라고 하며, 일반적으로 녹색 또는 황색 스펙트럼 영역에서 방출됩니다.

• 해결 방법: 시료의 자가형광이 강한 경우, 조직의 자연 발광이 훨씬 적은 원적색 또는 근적외선 영역에서 방출하는 형광단으로 변경해 보십시오. 자가형광을 소광하도록 설계된 상용 화학 소광제를 사용할 수도 있습니다.

고정 처리 문제

파라포름알데히드나 글루타르알데히드와 같은 화학 물질을 사용하여 세포를 보존(고정)하면, 이러한 물질이 가교 결합을 형성하고 형광 화합물을 생성하여 배경 잡음이 크게 증가할 수 있습니다.

• 해결 방법: 고정액의 농도를 낮추거나 시료가 고정액에 노출되는 시간을 줄이십시오. 글루타르알데하이드를 사용하는 경우, 이후 붕소수소화나트륨이라는 화학 물질로 시료를 처리하여 발광 효과를 중화할 수 있습니다.

하드웨어: 광학 및 기기 설정

시료가 완벽하게 준비되었더라도 장비가 빛을 올바르게 감지하지 못할 수 있습니다. 광학 부품은 유효 신호와 불필요한 노이즈를 분리하는 데 매우 중요한 역할을 합니다.

서로 일치하지 않는 광학 필터

모든 형광 광학 시스템에서 광학 필터는 빛을 선별하는 역할을 합니다. 여기 필터는 올바른 파장의 빛만 시료에 입사되도록 하고, 다이크로익 미러는 빛의 경로를 바꾸며, 방출 필터는 형광단에서 나오는 특정 형광을 제외한 모든 빛을 차단합니다.

방출 필터의 "대역 통과 범위"(통과시키는 빛의 범위)가 너무 넓으면 신호와 함께 산란광, 자가형광 및 기타 불필요한 노이즈도 통과합니다.

• 해결 방법: 광학 부품의 사양을 확인하십시오. 사용 중인 특정 형광단의 방출 피크와 정확히 일치하는 협대역 대역 통과 방출 필터를 사용해야 합니다. 고품질 하드 코팅 광학 필터로 교체하면 배경광 누설을 크게 줄일 수 있습니다.

카메라 및 검출기 설정

카메라 노출 시간이 너무 길거나 검출기의 "게인"(디지털 밝기)을 너무 높게 설정하면 실제 신호만큼 배경 노이즈도 증폭됩니다.

• 해결 방법: 노출 시간이나 게인을 낮추십시오. 모든 부분이 하얗게 날아간 밝은 이미지보다 깨끗하고 어두운 배경을 유지한 약간 어두운 이미지를 촬영하는 것이 항상 더 좋습니다.

빠른 문제 해결 체크리스트

현재 보고 있는 이미지에 노이즈가 많다면 다음 단계를 순서대로 시도하십시오.

1. 다시 세척: 더 오랫동안 두 차례 추가 세척하여 배경 신호가 씻겨 나가는지 확인합니다.
2. 설정을 확인하십시오: 카메라 노출을 낮추고 광학 필터 큐브를 확인하십시오.
3. 음성 대조군 실행: 형광단을 첨가하지 않은 시료를 관찰합니다. 그래도 빛이 나면 자가형광이 있는 것입니다.
4. 희석: 다음에는 형광단의 양을 절반으로 줄이십시오.

결론

높은 배경 신호가 치명적인 오류인 경우는 드뭅니다. 대개 변수 하나를 약간 조정해야 한다는 신호일 뿐입니다. 염료 농도를 세심하게 제어하고, 적절히 블로킹하며, 광학 부품이 필요한 빛만 정확하게 필터링하도록 하면 노이즈를 제거하고 원하는 선명한 결과를 얻을 수 있습니다.