Wie erfolgt die Immunfluoreszenzfärbung?

Immunfluoreszenzfärbung

Einführung

Die Immunfluoreszenzfärbung ist eine Technik zur Visualisierung spezifischer Proteine ​​oder Antigene in Zellen oder Gewebeschnitten. Dabei wird die Spezifität von Antikörpern zur Bindung an ihr Antigen genutzt und diese durch ein Fluoreszenzmikroskop visualisiert. Mit dieser Methode können Forscher das Vorhandensein, die Menge und die Lokalisierung von Zielmolekülen in Zellen oder Gewebeschnitten untersuchen.

Materialien und Reagenzien

• Probe (Zellen oder Gewebeschnitte)
• Primärer Antikörper, der spezifisch auf das Zielantigen wirkt
• Fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper
• Blockierungslösung (z. B. BSA oder Serum)
• Pufferlösungen (z. B. PBS)
• Fixiermittel (z. B. Formaldehyd)
• Permeabilisierungslösung (z. B. Triton X-100)
• Eindeckmedium
• DAPI oder andere Kernfärbungen (optional)

Verfahren

1. Probenvorbereitung: Die Zellen oder Gewebeschnitte werden mit einem Fixiermittel wie Formaldehyd fixiert, um die Zellstruktur zu erhalten und die Proteine ​​zu immobilisieren. Anschließend erfolgt ein Permeabilisierungsschritt, üblicherweise mit Detergenzien wie Triton X-100, um die Zugänglichkeit von Antikörpern zu intrazellulären Antigenen zu erhöhen.


2. Blockierung: Um eine unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern, wird die Probe in einer Blockierungslösung inkubiert, die normalerweise aus Rinderserumalbumin (BSA) oder Serum besteht.


3. Inkubation des primären Antikörpers: Die Probe wird mit einem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch für das Zielantigen ist. Die Inkubation des primären Antikörpers kann mehrere Stunden bis über Nacht bei Temperaturen durchgeführt werden, die eine optimale Bindung begünstigen, üblicherweise bei 4 Grad Celsius.


4. Waschen: Nach der Inkubation wird die Probe mit Puffer gewaschen, um alle ungebundenen Primärantikörper zu entfernen.


5. Inkubation des Sekundärantikörpers: Ein fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper, der sich an den Primärantikörper bindet, wird auf die Probe aufgetragen. Dieser Antikörper ist mit einem Fluorophor konjugiert, der bei Anregung durch bestimmte Wellenlängen Licht emittiert.


6. Weiteres Waschen: Überschüssiger Sekundärantikörper wird mit Puffer abgewaschen.


7. Kernfärbung (optional): Wenn der Zellkern sichtbar gemacht werden muss, kann zur Färbung des Zellkerns ein DNA-bindender Farbstoff wie DAPI verwendet werden.


8. Montage: Die Probe wird mit einem Medium montiert, das die Fluoreszenz bewahrt und Photobleichung verhindert. Über die Probe wird ein Deckglas gelegt, um die Lichtbrechung zu verringern.


9. Mikroskopie: Die Probe wird unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und die Fluoreszenzsignale werden erkannt und abgebildet. Wenn mehrere Ziele visualisiert werden müssen, können mehrere Färberunden durchgeführt werden, vorausgesetzt, die Fluorophore weisen unterschiedliche Anregungs- und Emissionsspektren auf.

Abschluss

Die Immunfluoreszenzfärbung ist eine leistungsfähige und weit verbreitete Technik in der Zellbiologie und Pathologie zum spezifischen Nachweis von Proteinen in Zellen und Gewebeschnitten. Dabei werden spezifische Antikörper, Fluoreszenzfarbstoffe und entsprechende Protokolle verwendet, um Bilder zu erzeugen, die bei der Untersuchung zellulärer Funktionen, Strukturen und Wechselwirkungen hilfreich sind.