Was ist die Stokes-Verschiebung in der Durchflusszytometrie?

Stokes-Shift in der Durchflusszytometrie

Die Stokes-Verschiebung bezeichnet den Wellenlängenunterschied zwischen der Spitzenanregung und der Spitzenemission eines in der Durchflusszytometrie verwendeten Fluorophors. Ein Fluorophor ist ein Molekül, das bei Lichtanregung Licht wieder emittieren kann. Die Anregung erfolgt, wenn ein Photon einer bestimmten Wellenlänge vom Fluorophor absorbiert wird, wodurch der Fluorophor in einen höheren Energiezustand versetzt wird. Wenn der Fluorophor in seinen Grundzustand zurückkehrt, emittiert er ein Lichtphoton, was den Emissionsvorgang darstellt.

Die Bedeutung der Stokes-Verschiebung ist in der Durchflusszytometrie vielfältig:

• Es ermöglicht die Trennung des Anregungslichts von der emittierten Fluoreszenz und erlaubt so eine genauere und empfindlichere Messung des Fluoreszenzsignals.
• Es ermöglicht Multiplexing, bei dem mehrere Fluorophore mit jeweils unterschiedlichen Stokes-Verschiebungen gleichzeitig verwendet werden können, um mehrere Parameter einer einzelnen Zelle zu bewerten.

Die Stokes-Verschiebung wird durch die Wellenlängendifferenz (normalerweise in Nanometern gemessen) zwischen dem Absorptions- und dem Emissionspeak quantifiziert. Eine größere Stokes-Verschiebung ist im Allgemeinen von Vorteil, da sie die Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum eines Fluorophors und dem Anregungsspektrum eines anderen minimiert und so den spektralen Überlauf verringert.

Bei der Durchflusszytometrie werden Laser als Anregungsquelle verwendet und die Detektoren sind mit Filtern ausgestattet, um die Emissionswellenlängen zu isolieren. Die Stokes-Verschiebung kann leicht in einem Fluoreszenzspektrumdiagramm visualisiert werden, in dem die Trennung zwischen dem Anregungspeak und dem Emissionspeak klar dargestellt ist.

Der Durchflusszytometer kann die Emission jedes Fluorophors aufgrund der einzigartigen Spektraleigenschaften unterscheiden, die durch die Stokes-Verschiebung hervorgerufen werden. Bei der Optimierung von Fluorophor-Panels muss die Stokes-Verschiebung berücksichtigt werden, um Überlappungen zu minimieren und die Nachweisfähigkeit zu maximieren.

Beispiele für Stokes-Verschiebungen für häufig in der Durchflusszytometrie verwendete Fluorophore