Was sind Fluorophore und Photobleaching?
Zum Verständnis der Photobleichung ist es hilfreich zu wissen, was ein Fluorophor ist. Man kann sich einen Fluorophor als mikroskopisch kleinen, wiederaufladbaren Leuchtstab vorstellen, mit dem Wissenschaftler bestimmte Bestandteile einer Zelle markieren und unter dem Mikroskop sichtbar machen. Werden diese winzigen Marker mit Licht einer bestimmten Farbe bestrahlt, absorbieren sie die Energie und emittieren Licht einer anderen Farbe.
Diese mikroskopisch kleinen Leuchtstäbchen leuchten jedoch nicht ewig. Photobleichung bezeichnet den Prozess, bei dem ein Fluorophor seine Fähigkeit zur Fluoreszenz verliert. Der Marker ist nicht wiederverwendbar, sondern „brennt“ dauerhaft aus und bleibt dunkel.
Die Rolle des Lichts: Warum die Intensität wichtig ist
So wie eine echte Glühlampe viel schneller durchbrennt, wenn zu viel Strom durch sie fließt, bleicht ein Fluorophor viel schneller aus, wenn es mit zu intensivem Licht bestrahlt wird.
Wenn die Intensität der Lichtquelle eines Mikroskops erhöht wird, werden die Fluorophore schlagartig mit einer enormen Energiemenge bestrahlt. Dadurch leuchtet die Probe zunächst zwar sehr hell, doch der Ausbleichprozess wird drastisch beschleunigt. Eine Probe, die bei geringer Lichtintensität möglicherweise minutenlang gleichmäßig fluoresziert, kann bei maximaler Intensität innerhalb weniger Sekunden photobleichen.
Die Wissenschaft einfach erklärt: Warum „brennen“ sie durch?
Wenn Licht auf ein Fluorophor trifft, wird das Molekül „angeregt“ (es absorbiert Energie). Normalerweise gibt es diese Energie als Leuchten ab und kehrt in seinen Grundzustand zurück, sodass es erneut angeregt werden kann.
Gelegentlich geht jedoch etwas schief. Befindet sich das Molekül in seinem hochenergetischen, angeregten Zustand, wird es sehr instabil und reaktiv. Wenn es mit bestimmten Molekülen in seiner Umgebung zusammenstößt, insbesondere mit Sauerstoff, erfährt es eine dauerhafte chemische Veränderung. Seine Struktur zerfällt buchstäblich.
Wenn Sie eine Lichtquelle hoher Intensität verwenden, werden die Fluorophore in schneller Folge immer wieder in diesen instabilen, angeregten Zustand versetzt. Da sie fortwährend in diesem empfindlichen Zustand gehalten werden, steigt die Wahrscheinlichkeit drastisch, dass sie mit Sauerstoff reagieren und dauerhaft zerfallen, bevor sie sich entspannen können.
Wie sich Photobleaching verhindern oder verlangsamen lässt
Da eine hohe Lichtintensität eine der Hauptursachen ist, lässt sich die Fluoreszenz der Proben am besten verlängern, indem die Lichteinwirkung kontrolliert wird. Wissenschaftler schützen ihre Fluorophore mit einigen einfachen Methoden:
- Helligkeit reduzieren: Die einfachste Lösung besteht darin, die Intensität der Lichtquelle zu verringern. In der Regel ist es besser, schwächeres Licht zu verwenden und den Kameraverschluss etwas länger geöffnet zu lassen, um das Bild aufzunehmen.
- Belichtungszeit begrenzen: Schalten Sie das Licht nur genau dann ein, wenn Sie die Probe betrachten oder fotografieren müssen. Jede Sekunde im Dunkeln schützt die Probe eine weitere Sekunde vor dem Ausbleichen.
- Chemische Schutzmittel verwenden: Wissenschaftler geben ihren Proben häufig spezielle chemische Lösungen hinzu, die als „Antifade-Reagenzien“ bezeichnet werden. Diese Chemikalien wirken wie Schutzmittel, indem sie den reaktiven Sauerstoff aus der Umgebung aufnehmen, sodass dieser die angeregten Fluorophore nicht angreifen und zerstören kann.
- Robustere Fluorophore auswählen: Einige moderne, speziell entwickelte Fluorophore sind widerstandsfähiger als ältere, natürliche Fluorophore und können höheren Lichtintensitäten länger standhalten.
Zusammenfassung
Eine hohe Lichtintensität ist eine direkte Ursache für Photobleichen. Wird einem Fluorophor zu viel Lichtenergie zugeführt, verbleibt es in einem instabilen, hochreaktiven Zustand. Dadurch steigt die Wahrscheinlichkeit, dass es sich chemisch zersetzt und seine Fluoreszenzfähigkeit verliert. Durch die Steuerung von Lichtintensität und Belichtungszeit lässt sich die Lebensdauer einer fluoreszierenden Probe deutlich verlängern.
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