Ja, es ist durchaus möglich, mit nur einer Lichtquelle mehrere Fluorophore gleichzeitig anzuregen. Dies ist ein sehr gängiges Verfahren in der Biologie und Chemie, um verschiedene Bereiche einer Zelle oder Probe gleichzeitig zu untersuchen. Dafür müssen das geeignete Licht und die passende Hardware zu dessen Steuerung ausgewählt werden.
Was ist ein Fluorophor?
Stellen Sie sich ein Fluorophor als einen mikroskopisch kleinen Reflektor vor, der die Farbe des Lichts verändert. Wenn Licht einer bestimmten Farbe darauf trifft (das Anregungslicht), absorbiert das Fluorophor diese Energie und leuchtet, wobei es Licht einer anderen Farbe abgibt (das Emissionslicht). Ein Fluorophor kann beispielsweise blaues Licht absorbieren und grünes Licht emittieren.
Wie eine einzige Lichtquelle mehrere Zielstoffe anregen kann
Es gibt zwei Hauptmethoden, mit denen eine einzelne Lichtquelle mehrere verschiedene Fluorophore gleichzeitig anregen kann:
- Die Leistung von breitbandigem Licht: Einige Lichtquellen, wie spezielle Weißlicht-LEDs oder Halogenlampen, erzeugen ein breites „Breitbandspektrum“. Das bedeutet, dass sie blaues, grünes, rotes und gelbes Licht gleichzeitig abstrahlen. Da all diese Farben in einem einzigen Strahl vorhanden sind, können Sie einen blau absorbierenden und einen rot absorbierenden Fluorophor exakt gleichzeitig anregen.
- Gemeinsame Anregungsbereiche: Manchmal überschneiden sich die Anregungsspektren verschiedener Fluorophore. Zwei unterschiedliche Fluorophore können beispielsweise durch exakt denselben Blauton angeregt werden, wobei das eine grünes Licht und das andere rotes Licht emittiert. Ein einzelner blauer Laser oder ein schmalbandiges Lichtbündel kann beide gleichzeitig anregen.
Die verborgene Hardware: optische Komponenten
Wenn eine Probe mit weißem Licht bestrahlt wird, um mehrere Fluorophore anzuregen, stellt sich die Frage, wie sich die Ergebnisse klar erkennen lassen, ohne dass alles in einem blendend weißen Lichtschein verschwindet. Hier werden die optischen Komponenten zum wichtigsten Teil des Systems.
Um die Lichtsignale nutzbar zu machen, werden spezielle optische Filter zur gezielten Lichtführung eingesetzt:
- Anregungsfilter: Diese befinden sich vor der Lichtquelle. Bei einer breitbandigen Lichtquelle wirkt dieser Filter wie ein Türsteher: Er lässt nur genau die Lichtfarben zur Probe passieren, die zur Anregung der jeweiligen Fluorophore benötigt werden, und blockiert den Rest.
- Dichroitische Spiegel: Dies sind hoch spezialisierte Glassubstrate, die schräg angeordnet werden. Sie reflektieren das Anregungslicht nach unten auf die Probe, lassen jedoch das von den Fluorophoren emittierte Fluoreszenzlicht geradlinig zum Auge oder zur Kamera passieren.
- Emissionsfilter: Diese werden unmittelbar vor der Kamera oder dem Okular platziert. Sie blockieren jegliches Streulicht der Lichtquelle und lassen nur die spezifischen Leuchtfarben, also das Emissionslicht, der Fluorophore passieren. Dadurch erhalten Sie einen klaren, dunklen Hintergrund mit hell leuchtenden Zielstrukturen.
Eine häufige Herausforderung: „Übersprechen“ oder „Durchbluten“
Bei der gleichzeitigen Anregung mehrerer Fluorophore muss auf „Übersprechen“ geachtet werden. Dieses tritt auf, wenn das von Fluorophor A emittierte Licht versehentlich den für Fluorophor B vorgesehenen optischen Filter passiert. Dadurch kann der Eindruck entstehen, dass Fluorophor B vorhanden ist, obwohl dies nicht der Fall ist. Um dies zu vermeiden, müssen Fluorophore mit deutlich unterschiedlichen Emissionsfarben ausgewählt und hochpräzise optische Emissionsfilter eingesetzt werden, damit die Signale vollständig getrennt bleiben.
Zusammenfassung
Eine Lichtquelle kann zur Anregung mehrerer Fluorophore verwendet werden, üblicherweise durch den Einsatz von breitbandigem Licht oder durch die Auswahl von Fluorophoren mit derselben Anregungsfarbe. Entscheidend für diesen Prozess ist jedoch die Anordnung optischer Filter und Spiegel, die das Licht präzise trennt, sodass die verschiedenen leuchtenden Farben klar und genau erkennbar sind.
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