Was ist ein Fluoreszenzmikroskop?

Ein Fluoreszenzmikroskop ist ein hochspezialisiertes optisches Instrument, das Fluoreszenz und Phosphoreszenz nutzt, um die Eigenschaften organischer oder anorganischer Substanzen zu untersuchen, anstatt sich ausschließlich auf die herkömmliche Reflexion, Streuung oder Absorption von Licht zu stützen.

Dieses Verfahren ist in der Biologie und Materialwissenschaft äußerst wertvoll, da Forschende damit bestimmte Strukturen, Moleküle oder Proteine in einer Probe mit hohem Kontrast und hoher Spezifität lokalisieren können.

Funktionsweise

Das Grundprinzip beruht auf Molekülen, die als Fluorophore bezeichnet werden. Wird ein Fluorophor mit Licht einer bestimmten, energiereichen Wellenlänge (Anregung) beleuchtet, absorbiert er diese Energie und emittiert fast unmittelbar Licht mit geringerer Energie und längerer Wellenlänge (Emission).

Das Mikroskop ist so ausgelegt, dass es die Probe mit Anregungslicht bestrahlt und anschließend ausschließlich das emittierte Licht erfasst. Dadurch entsteht ein helles Bild der Zielstrukturen vor einem dunklen Hintergrund.

Optische Kernkomponenten

Um diese spezifische Lichtführung zu erreichen, verwendet ein Fluoreszenzmikroskop eine spezielle Anordnung optischer Komponenten, die üblicherweise in einem „Filterwürfel“ untergebracht sind:

• Lichtquelle: Liefert das für die Anregung erforderliche hochintensive Licht. Zu den gängigen Quellen gehören Laser, LEDs, Quecksilberdampflampen und Xenonbogenlampen.
• Anregungsfilter: Ein optischer Filter, der im Strahlengang der Lichtquelle platziert wird. Er fungiert als selektive Sperre, indem er nur die spezifische Lichtwellenlänge durchlässt, die zur Anregung des Fluorophors in der Probe erforderlich ist, und alle anderen Wellenlängen blockiert.
• Dichroitischer Spiegel (oder Strahlteiler): Dieser wird in einem Winkel von 45° zum Strahlengang angeordnet. Er ist so ausgelegt, dass er das kurzwellige Anregungslicht durch das Objektiv auf die Probe reflektiert. Für das von der Probe zurückkehrende langwellige Emissionslicht ist er jedoch transparent, sodass dieses direkt zum Detektor passieren kann.
• Objektiv: Fokussiert das Anregungslicht auf die Probe, sammelt die relativ schwache emittierte Fluoreszenz und leitet sie zurück zum dichroitischen Spiegel.
• Emissionsfilter (oder Sperrfilter): Er befindet sich zwischen dem dichroitischen Spiegel und dem Detektor (oder Okular). Er blockiert gestreutes Anregungslicht, das den dichroitischen Spiegel passiert hat, sodass nur die reine emittierte Fluoreszenz das endgültige Bild erreicht.
• Detektor: Eine hochempfindliche Kamera (z. B. eine CCD-, CMOS- oder Photomultiplier-Röhre), die das endgültige Bild erfasst, da die Fluoreszenzsignale häufig sehr schwach sind.