Einführung
Um das Übersprechen zu verstehen, müssen wir zunächst wissen, wie Wissenschaftler mikroskopisch kleine Strukturen wie Zellen untersuchen. Sie verwenden Fluorophore, winzige leuchtende molekulare „Textmarker“, die sich an bestimmte Teile einer Zelle anlagern. Wenn sie mit Laserlicht einer bestimmten Farbe bestrahlt werden (die sogenannte Anregung), absorbieren sie die Energie und leuchten in einer anderen Farbe (die sogenannte Emission). Beispielsweise könnte man den Zellkern mit einem grünen Fluorophor und die äußere Membran mit einem roten Fluorophor markieren.
Das Grundkonzept: Die Form des Lichts (Spektren)
Man könnte sich leicht vorstellen, dass ein grüner Fluorophor einen vollkommen reinen grünen Lichtstrahl aussendet. In Wirklichkeit ist das Spektrum jedoch wesentlich komplexer. Ein grüner Fluorophor emittiert überwiegend grünes Licht, leuchtet aber auch ein wenig gelb, in sehr geringem Maß orange und möglicherweise mit einer schwachen Spur von Rot.
Wenn die von einem Fluorophor emittierten Farben in einem Diagramm aufgetragen werden, ergibt sich ein breiter Hügel oder eine Glockenkurve. Diese Kurve wird als Emissionsspektrum bezeichnet.
Was ist spektrales Übersprechen (Crosstalk)?
Spektrales Übersprechen (oft als Crosstalk bezeichnet) tritt auf, wenn zwei oder mehr Fluorophore gleichzeitig verwendet werden und sich ihre Lichtkurven überlappen.
Geräte wie Mikroskope oder Durchflusszytometer verwenden spezielle farbige Glasfenster, sogenannte Filter, um das emittierte Licht zu erfassen. Ein „Grünfilter“ ist so ausgelegt, dass nur grünes Licht zur Kamera gelangt, während ein „Rotfilter“ nur rotes Licht erfasst.
Was geschieht jedoch, wenn sich das Auslaufende der Kurve Ihres grünen Fluorophors bis in den roten Bereich erstreckt? Dieses zusätzliche Licht „schlägt durch“ den Rotfilter durch. Die Kamera erfasst das Licht und nimmt an, dass es vom roten Fluorophor stammt, tatsächlich handelt es sich jedoch lediglich um Restlicht des grünen Fluorophors.
Eine Analogie aus der Praxis: Das Farbglasproblem
Stellen Sie sich vor, Sie haben eine sehr helle gelbe Taschenlampe und eine deutlich schwächere orangefarbene Taschenlampe. Sie möchten die Helligkeit der orangefarbenen Taschenlampe bestimmen und betrachten sie daher durch eine orange getönte Sonnenbrille.
Die Sonnenbrille soll nur orangefarbenes Licht durchlassen. Da die gelbe Taschenlampe jedoch extrem hell ist, dringt ein kleiner Teil ihres Lichts durch die orangefarbenen Gläser. Selbst wenn die orangefarbene Taschenlampe ausgeschaltet ist, sehen Sie möglicherweise noch Licht durch Ihre Sonnenbrille und nehmen fälschlicherweise an, dass sie eingeschaltet ist. Genau auf diese Weise führt Übersprechen bei wissenschaftlichen Kameras zu Verwechslungen.
Warum ist spektrales Übersprechen problematisch?
Spektrales Übersprechen erzeugt falsch positive Ergebnisse. Wenn ein Wissenschaftler das Blut eines Patienten auf das Vorhandensein einer bestimmten seltenen Immunzelle untersucht, die rot markiert ist, könnte das Übersprechen einer sehr häufigen, grün markierten Zelle den roten Detektor auslösen.
Dies beeinträchtigt die Genauigkeit der Daten. Der Wissenschaftler könnte allein aufgrund der Vermischung der Farben im Gerät zu dem Schluss kommen, dass die seltene Zelle vorhanden ist, obwohl sie tatsächlich nicht vorhanden ist.
Wie Wissenschaftler dies verhindern und beheben
Da Fluorophore stets breite, komplexe Lichtkurven aufweisen, nutzen Wissenschaftler verschiedene Strategien zur Begrenzung des Übersprechens:
- Gezielte Auswahl: Die einfachste Lösung besteht darin, Farben zu wählen, die im Spektrum sehr weit auseinanderliegen. Werden ein blauer und ein dunkelroter Fluorophor verwendet, liegen ihre Kurven so weit auseinander, dass sie sich überhaupt nicht überlappen.
- Engbandigere Filter: Durch die Aufrüstung des Mikroskops mit steileren, schmalbandigeren Filtern kann das überlappende Licht physisch daran gehindert werden, die Kamera zu erreichen.
- Kompensation: Dies ist ein mathematisches Verfahren. Computer können darauf trainiert werden, genau zu bestimmen, wie viel grünes Licht in den roten Kanal gelangt, zum Beispiel genau 15%. Der Computer zieht dann automatisch 15% von den roten Messdaten ab. Dadurch wird das Übersprechen rechnerisch entfernt und das tatsächliche Ergebnis sichtbar.
Zusammenfassung
Spektrales Übersprechen bedeutet, dass Licht eines Fluoreszenzmarkers in den für einen anderen Marker vorgesehenen Detektor gelangt. Da fluoreszierende Moleküle ein breites Farbspektrum statt eines einzelnen reinen Laserstrahls erzeugen, können sich ihre Emissionsspektren leicht überlappen. Durch die Wahl geeigneter Farben, den Einsatz hochwertiger Filter und mathematische Korrekturen lässt sich das Übersprechen reduzieren, sodass präzise, hochwertige Bilder entstehen.
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