Ein Epifluoreszenzmikroskop ist ein Lichtmikroskop, das Fluoreszenz anstelle von oder zusätzlich zu Streuung, Reflexion und Absorption nutzt, um die Eigenschaften organischer oder anorganischer Substanzen zu untersuchen. Der Begriff „Epi“ stammt vom griechischen Wort für „oben“ und bezieht sich darauf, dass Beleuchtung und Detektion von derselben Seite der Probe aus erfolgen, und zwar durch das Objektiv.

Funktionsprinzipien

Das Grundprinzip der Epifluoreszenz ist die Stokes-Verschiebung. Wenn eine Probe mit einem Fluorophor, also einer fluoreszierenden chemischen Substanz, markiert wird, absorbiert sie Licht einer bestimmten kürzeren Wellenlänge (Anregung) und emittiert Licht einer längeren, energieärmeren Wellenlänge (Emission).

1. Anregung: Hochintensives Licht wird auf eine bestimmte Wellenlänge gefiltert und von einem dichroitischen Spiegel durch das Objektiv auf die Probe reflektiert.
2. Emission: Die Fluorophore in der Probe emittieren Licht. Dieses Licht läuft durch das Objektiv zurück.
3. Trennung: Da das emittierte Licht eine längere Wellenlänge hat, wird es vom dichroitischen Spiegel durchgelassen, während das reflektierte Anregungslicht blockiert wird. Dadurch erreicht nur das Fluoreszenzsignal die Okulare oder die Kamera.

Physischer Aufbau

Der Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops wird durch den Fluoreszenzfilterwürfel bestimmt, der typischerweise drei entscheidende Elemente enthält:

• Anregungsfilter: Wählt aus der Lichtquelle den spezifischen Wellenlängenbereich zur Anregung der Probe aus.
• Dichroitischer Spiegel (Strahlteiler): Ein spezieller Spiegel, der kürzere Wellenlängen (Anregung) reflektiert und längere Wellenlängen (Emission) transmittiert. Er ist in einem Winkel von 45° zum Strahlengang angeordnet.
• Emissionsfilter (Sperrfilter): Blockiert jegliches restliche Anregungslicht und stellt sicher, dass nur die Fluoreszenz der Probe den Detektor erreicht.
• Lichtquelle: Traditionell werden Quecksilber- oder Xenonbogenlampen verwendet, während moderne Systeme überwiegend Hochleistungs-LEDs oder Laser einsetzen.

Wichtige optische Kenngrößen

Für die Bewertung oder Spezifikation eines Epifluoreszenzsystems sind die folgenden Kenngrößen wesentlich:

• Numerische Apertur (NA): Sie ist entscheidend, da das Objektiv sowohl als Kondensor (zur Lichtzuführung) als auch als Kollektor fungiert. Die Fluoreszenzintensität steigt mit der vierten Potenz der NA: Intensität ∝ (NA)4.
• Quantenausbeute: Das Verhältnis der vom Fluorophor emittierten Photonen zu den absorbierten Photonen.
• Extinktionskoeffizient: Ein Maß dafür, wie stark ein Fluorophor Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert.
• Signal-Rausch-Verhältnis (SNR): Die Fähigkeit, das Fluoreszenzsignal vom dunklen Hintergrund zu unterscheiden.

Klassifizierungen und Typen

• Aufrechte Epifluoreszenz: Das Objektiv befindet sich oberhalb des Objekttisches. Dies ist der Standardaufbau für präparierte Objektträger.
• Invertierte Epifluoreszenz: Das Objektiv befindet sich unter dem Objekttisch. Dies ist für die Beobachtung lebender Zellen in Kulturschalen oder -flaschen unerlässlich.
• Konfokale Fluoreszenzmikroskopie: Eine spezielle Variante, bei der eine Lochblende außerhalb der Fokusebene liegendes Licht ausblendet und so optische 3D-Schnitte ermöglicht.
• Fluoreszenzmikroskopie mit Totalreflexion (TIRF): Nutzt eine evaneszente Welle, um Fluorophore selektiv nur innerhalb von ~100 nm zur Glasoberfläche anzuregen.

Anwendungen

• Zellbiologie: Identifizierung bestimmter Proteine oder Organellen mithilfe des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) oder der Immunfluoreszenz.
• Genetik: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zum Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens bestimmter DNA-Sequenzen auf Chromosomen.
• Klinische Diagnostik: Nachweis von Krankheitserregern (z. B. den Bakterien, die Tuberkulose oder Malaria verursachen) in Patientenproben.
• Materialwissenschaft: Untersuchung von Halbleitern oder Mineralien, die Autofluoreszenz zeigen.

Praxisbeispiel: Nachweis von „Protein X“ in einer Krebszelle

In einer Laboruntersuchung möchte ein Forscher feststellen, ob ein bestimmtes Protein im Zellkern vorhanden ist.

1. Vorbereitung: Die Probe wird mit einem Primärantikörper behandelt, der an „Protein X“ bindet. Anschließend folgt ein Sekundärantikörper, der mit FITC (einem häufig verwendeten grünen Fluorophor) markiert ist.
2. Aufbau: Das Mikroskop ist mit einem „FITC-Filtersatz“ ausgestattet (Anregung: ~480nm; Emission: ~520nm).
3. Beobachtung: Blaues Licht wird durch das Objektiv geleitet. Beim Blick durch das Okular erscheint der Hintergrund tiefschwarz, während die Zellkerne in einem leuchtenden, scharf abgegrenzten Neongrün erstrahlen und so die Position des Proteins bestätigen.